百合的組織培養(yǎng)

2010/8/24 20:17:21

百合是百合科屬多年生草本鱗莖植物，是世界著名的觀賞花卉。全世界的本屬植物約有94種，主要分布在北半球的溫帶和寒帶地區(qū)，少數(shù)種類分布在熱帶高海拔地區(qū)。中國是百合屬植物分布最多的國家，也是世界百合起源的中心，據(jù)調(diào)查約有47種18個(gè)變種，占世界百合總數(shù)的一半以上，其中有36種15個(gè)變種為中國特有種。隨著我國花卉產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展20世紀(jì)80年代后期大量優(yōu)良的觀賞百合栽培品種陸續(xù)從荷蘭等國引進(jìn)我國�，F(xiàn)已得到廣泛栽培，成為我國花卉市場中的重要高檔切花種類。
關(guān)于百合的組織培養(yǎng)，國內(nèi)外不少研究者開展了大量的工作。在優(yōu)良品種快速繁殖、品種脫毒復(fù)壯、新品種培育以及種質(zhì)資源保存等方面，具有較為成熟的技術(shù)。
百合植株的不同部分均采用組織培養(yǎng)的方法，繁殖出新個(gè)體并進(jìn)行快速擴(kuò)繁。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，國內(nèi)外組織培養(yǎng)成功的百合種及品種已超過幾百種。最早是Dobreaux等人（1950）首次用純白百合（Liliumcandidum）的花蕾成功地誘導(dǎo)出小鱗莖。隨后Robb(1957)成功地進(jìn)行了2個(gè)種百合鱗片的培養(yǎng)結(jié)果如下。
鱗片腹軸面上、中、下三部分形成小鱗莖的百分率分別為0、3.8%及71.3%。春秋季鱗片形成子球率分別為77%及53%，夏季為2%，冬季為0。
Henser(1976)培養(yǎng)蘭州百合（L.davidiivar.unicolor）的花柱和花梗，通過愈傷組織途徑得到試管小鱗莖。
黃濟(jì)明（1979~1984）對25個(gè)種或品種進(jìn)行了組培試驗(yàn)，證明百合的珠芽、鱗片、鱗莖盤、根、莖、葉、莖尖、花梗、花柱和未成熟胚等外植體均能被促進(jìn)形態(tài)發(fā)生。新美芳二（1980）對百合鱗片、花被片、花絲、花柄等也組培成功，認(rèn)為開花時(shí)各花器官和莖所形成小鱗莖的能力最高。相增海（1983）用4個(gè)種的百合鱗片、莖段進(jìn)行培養(yǎng)證實(shí)。
種間分化率存在明顯差異。取處于休眠期的外植體進(jìn)行培養(yǎng)，其分化能力下降。
程治英等人（1991~2001）對30多種或品種的百合進(jìn)行組培證實(shí)的結(jié)果如下：
（1）用百合根、葉作為外植體，也與鱗片一樣，不同部位分化叢芽的能力都是近軸端大于遠(yuǎn)軸端。
（2）鱗莖鱗片分化能力（分化苗的頻率和速度）都是外部大于內(nèi)部。
雜種品種的分化能力大于野生種，低海拔種大于高海拔種。鱗片組培得到小鱗莖的試管鱗片其分化能力大于原始培養(yǎng)鱗片的分化能力。
王愛勤（1998）比較了9個(gè)品種分化小鱗莖的差異，結(jié)果表明不同品種的分化能力有明顯的不同，顯著高的達(dá)86%，低的僅13%。趙祥云（2000）等人報(bào)道：由花梗或花柱培養(yǎng)的小苗，雖然其鱗莖的培養(yǎng)途徑一樣，但從移栽到開花的時(shí)間可大大縮短，如麝香百合雜種系花柱培養(yǎng)的試管苗從移栽到開花只需半年多時(shí)間。李寶平等人（1992）對平陸百合(L.davidiivar.umicolor)組培中發(fā)生小鱗莖的條件及人工種皮包埋效果進(jìn)行了觀察和分析。他認(rèn)為百合鱗莖既是儲(chǔ)藏器官又是無性繁殖器官。從植株的整體結(jié)構(gòu)看，它位于中間偏下部位。從遺傳勢的角度出發(fā)，鱗片中偏下部位發(fā)生小鱗莖應(yīng)有的較強(qiáng)遺傳勢，組培中小鱗莖發(fā)生的能力最強(qiáng)，這既符合生物的遺傳優(yōu)勢理論，又符合組培實(shí)際情況。屈云慧等人近期對從國外引進(jìn)的100余個(gè)百合品種進(jìn)行了組培研究及快繁生產(chǎn)，在短期內(nèi)獲得了大量的組培種苗。
有效的培養(yǎng)方法
1、培養(yǎng)基配方
誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L
增殖培養(yǎng)基：MS+BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L
生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA0.1mg/L
2、培養(yǎng)程序
取材及滅菌優(yōu)選生長健壯、開花性狀好的種球作為外植體。在取材前，最好將準(zhǔn)備接種的鱗莖在4~5℃的低溫下處理6~8周，然后經(jīng)洗衣粉常規(guī)清洗后，剝?nèi)�鱗莖外皮及外部2~3層鱗片，切去少許頂部及基部，先用75%的酒精浸泡30~60S，然后在0.1%升汞溶液中處理15~20分鐘，次氯酸鈉處理10~15分鐘，無菌水洗3~4次，即可進(jìn)行無菌操作切塊（段）接種�；ㄆ鞴俚扰囵B(yǎng)時(shí)，常取未開放的花蕾，消毒后切開，取其內(nèi)部器官接種。生長及分化鱗莖切塊經(jīng)20天后，切口便產(chǎn)生白色的小鱗莖突起，這時(shí)可將其切成數(shù)塊進(jìn)行繼代培養(yǎng)。在增殖培養(yǎng)基中小鱗莖有所增殖，并抽出葉片，成為幼苗，將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，10天左右便可有根形成。此時(shí)即可出瓶移栽。在高NAA低BA的培養(yǎng)基中，通過鱗片培養(yǎng)可一次形成完整植株，但幼苗根部有腫脹現(xiàn)象。相反，在高BA和低NAA時(shí)，能形成大量的小鱗莖狀突起，從中分化出大量的芽，但無根的分化。趙祥云（1996）提出培養(yǎng)基MS+NAA0.03mg/L能夠促進(jìn)百合鱗莖的發(fā)育，說明生長素在誘導(dǎo)百合生根的同時(shí)也促進(jìn)鱗莖的發(fā)育；MS+BA0.03mg/L+NAA0.03mg/L對百合鱗莖的生長有利，而NAA與BA配合使用時(shí)NAA/BA的比值小則有利于百合鱗莖的形成。同時(shí)，溫度對組培小鱗莖的生長極為重要。百合組培苗生長的最適溫度為18~22℃，隨溫度升高或降低則生長狀況不佳。另外對百合組培苗進(jìn)行暗處理也有利于誘導(dǎo)百合鱗莖的形成。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及調(diào)控技術(shù)
利用組培技術(shù)快速繁殖百合，除要求具有較高的繁殖系數(shù)、芽形成根的時(shí)間短和過渡移栽有較高的成活率外，更重要的是新生的子代都必須與母體保持一致的物理、化學(xué)和遺傳特征。涉及組培遺傳穩(wěn)定性的研究者Sheridan(1975)認(rèn)為鐵炮百合愈傷組織培養(yǎng)6年后，其染色體數(shù)和再生能力無變化。Ahloowalia(1978)認(rèn)為百合愈傷組織經(jīng)長期培養(yǎng)后，其染色體數(shù)目、葉形和大小、花的發(fā)育、生長優(yōu)勢、成活率、多年生性狀等都有所變化，但這些變化不能有性傳遞。Stimart(1980)也指出百合愈傷組織經(jīng)長期循環(huán)培養(yǎng)，植株活力、葉斑等發(fā)生變化，但改變的特征不能有性傳遞。細(xì)木高志（1981）認(rèn)為百合科植物在栽培中染色體是不穩(wěn)定的，但直接從外植體再生的植株就不會(huì)發(fā)生此類情況。景忠平（1989）報(bào)道，鐵炮百合葉、花被、花枝和子房等外植體培養(yǎng)3年，其分化能力不下降。李耿光等（1983）培養(yǎng)百合莖段，通過愈傷組織途徑進(jìn)行繁殖，培養(yǎng)8代后其分化能力就已下降，但這種結(jié)果的形成可能是在組織培養(yǎng)過程中使用激素不當(dāng)所致（報(bào)道中他所用KT含量為10mg/L）。
關(guān)于百合組培的實(shí)用化研究，國內(nèi)外不少研究者為此做出了貢獻(xiàn)。Takayma等（1980）研究了百合鱗片組培形成小鱗莖的過程，考察了鱗片生理年齡、活性炭、糖濃度等對培養(yǎng)效果的影響。1982年，他又采用固體和液體培養(yǎng)基結(jié)合連續(xù)光照等措施，達(dá)到了快繁大量小鱗莖的目的。新美芳二（1985）研究了光（0、8、16、24H）和溫度（20~30℃）對鱗片分化小鱗莖的影響。Scaramazz等（1988）提出經(jīng)4℃低溫處理4~6周的小鱗片，可提前12~20D分化小鱗莖，并指出采用定期供氧和營養(yǎng)液的生物反應(yīng)裝置來生產(chǎn)小鱗莖是可行的。唐世富等人（1988~1991）、劉選明等人（1996~1998）通過ABT等新型添加劑在百合組織培養(yǎng)中的應(yīng)用，探討了組培條件的優(yōu)化等。溫春秋秀等（1997）在進(jìn)行新鐵炮百合的培養(yǎng)中，用微生物多糖固化劑GellanGum2g/L代替瓊脂，節(jié)約了組培成本。王愛勤（1998）指出糖濃度為10%和添加10mg/L的多效唑（PP333）可促進(jìn)小鱗莖的生長。
另外還有許多對試管鱗莖休眠現(xiàn)象做了闡述：如鐵炮百合30℃下的小鱗莖不休眠，而25℃下的絕大部分鱗莖休眠；低鹽低糖和高氮培養(yǎng)基上的小鱗莖不休眠，而高糖（9%）培養(yǎng)基上的小鱗莖會(huì)出現(xiàn)休眠現(xiàn)象。不同的品種在3~6℃的溫度下39~120D可打破休眠。一般亞洲百合所需時(shí)間短（約30天），而東方百合所需時(shí)間長（約2~3個(gè)月）。休眠現(xiàn)象還與培養(yǎng)小鱗莖時(shí)所用的糖濃度有關(guān)（Takayama等1982）；3%糖濃度培養(yǎng)下得到的小鱗莖在5℃下約2個(gè)月可打破休眠，而9%糖濃度下培養(yǎng)得到的小鱗莖要冷藏約4個(gè)月。我們在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度較高（40g/L）對小鱗莖的形成和長大有利。如糖濃度降到20g/L，小鱗莖很快能長成幼苗。因此，可用糖濃度控制小鱗莖的生長，使幼苗生長健壯，提高成活率。也有人在組培前用4℃的低溫處理鱗片120D，在經(jīng)組培所得到的小鱗莖不發(fā)生休眠現(xiàn)象。
試管苗或試管小鱗莖在栽培中的開花時(shí)間也因種而異，如外引雜交品種和新鐵炮百合當(dāng)年可開花，而毛百合、川百合和透百合等要15~24個(gè)月開花，蘭州百合需3~4年才開花。
出瓶苗的過渡移栽利用種子發(fā)芽箱進(jìn)行百合組培苗過渡培養(yǎng)，可使移栽苗容易適應(yīng)外界環(huán)境條件。當(dāng)移栽苗放入種子發(fā)芽箱時(shí)，通過提高溫度和濕度，使環(huán)境接近培養(yǎng)瓶的環(huán)境。3~4天后將覆蓋物稍敞開，使溫度和濕度降低，為移栽苗進(jìn)一步適應(yīng)外界環(huán)境創(chuàng)造條件。根長范圍在0~1.0cm之間的幼苗，適應(yīng)性強(qiáng)，生長快，生命力旺盛，適應(yīng)性短，根系的生長量大，有利于幼苗的健壯入土；而根系較長的幼苗剛從瓶內(nèi)出來時(shí)雖長的很壯，但它的生長勢過旺，適應(yīng)力有所降低，抗逆性差，環(huán)境稍不適宜，就易造成根系的損傷或腐爛，從而影響整個(gè)幼苗的生長。因此，應(yīng)選擇組培幼苗的根系剛剛萌生正要生長的時(shí)期進(jìn)行移植。過渡培養(yǎng)的前7天內(nèi)，在1/4倍濃度培養(yǎng)液的條件下，幼苗的生長量最大；在7~15天的一段時(shí)間內(nèi)，在1/3倍濃度培養(yǎng)液的條件下幼苗的生長量最大；而移植入土后，在1/2倍濃度培養(yǎng)液的條件下幼苗的生長最為迅速。移栽的基質(zhì)也很重要，必須具有良好的土壤結(jié)構(gòu)，使土壤疏松，有利于植株的生長和扎根。試驗(yàn)證明：1/3沙土±1/3草炭+1/3腐殖土是移栽百合組培幼苗較理想的基質(zhì)。

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