垂花蕙蘭叢生芽途徑的組織培養(yǎng)技術(shù)

2020/2/14 12:16:43

垂花蕙蘭系以花葶下垂的多花蘭、硬葉吊蘭、紫紋蘭、濕地蘭、溝唇蘭、地旺蘭等為親本與大花蕙蘭雜交產(chǎn)生的后代，花多色艷，開花期長達(dá)30-60天，該花雖然繁殖系數(shù)高，但是再生植株容易出現(xiàn)變異，本實驗從無菌材料獲得不同濃度6-BA 對叢生芽誘導(dǎo)和增殖的影響，主要是為了建立垂花蕙蘭叢生芽增殖途徑的離體快繁技術(shù)體系，接下來小編就來詳細(xì)說說。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗所用材料來自三明市農(nóng)科院花卉研究所垂花蕙蘭。
1.2 方法
1.2.1 無菌材料獲得
材料的預(yù)處理：在取側(cè)芽之前要進(jìn)行消毒，可以采取以下措施：
采用溫室栽培母株、定期給母株噴灑1000 倍50%甲基托布津藥液、在春季晴天上午取材、盡量取高于栽培基質(zhì)的側(cè)芽。
側(cè)芽的表面消毒：用手術(shù)刀采取飽滿葉片尚未展開的側(cè)芽，切去根后用自來水沖洗20分鐘，轉(zhuǎn)入凈化工作臺，可采用以下四種方法進(jìn)行表面消毒：
A：用0.1%的升汞溶液處理10min，用無菌水沖洗3-4 次，無菌濾紙吸干，再剝?nèi)ネ饷?-2片葉，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
B：先用72%乙醇浸泡30s，然后用0.1%的升汞溶液處理10min，用無菌水沖洗3-4 次，無菌濾紙吸干，再剝?nèi)ネ饷?-2 片葉，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
C：先用72%乙醇浸泡30s，然后用0.1%的升汞溶液處理8min，用無菌水沖洗3-4 次，剝?nèi)ネ饷?-2 片葉，再用15%的次氯酸鈉溶液處理4min，無菌水沖洗3-4 次，無菌濾紙吸干，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
D：先用72%乙醇浸泡30s，然后用15%的次氯酸鈉溶液處理10min，用無菌水沖洗3-4次，無菌濾紙吸干，再剝?nèi)ネ饷?-2 片葉，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
不同取材季節(jié)對側(cè)芽消毒效果的影響：分別在春季3月、夏季6月和秋季9月采取側(cè)芽，進(jìn)行表面消毒處理后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。觀察不同取材季節(jié)對側(cè)芽消毒的影響，以上誘導(dǎo)培養(yǎng)基均為1/2MS+6-BA4.0 mg· L-1+NAA0.1 mg · L-1+AC0.5 g · L-1。
1.2.2 叢芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)
選取健壯、無病蟲害、葉片尚未完全展開的垂花蕙蘭側(cè)芽，采用消毒方法C進(jìn)行表面消毒處理，將消毒好的腋芽接種到6-BA 濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0 mg · L-1誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.1mg · L-
1+AC0.5 g· L-1 上進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)，觀察不同濃度6-BA 對叢生芽誘導(dǎo)影響。
1.2.3 叢芽的增殖培養(yǎng)
將誘導(dǎo)獲得的無菌芽接種到培養(yǎng)基1/2MS+6-BA4.0 mg · L-1+NAA0.1 mg · L-1+AC0.5 g·L-1 上繼代培養(yǎng)3 次后獲得足夠的材料，然后接種到到6-BA 濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0 mg · L-1 增殖培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.1mg· L-1+AC0.5 g · L-1 上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，觀察不同濃度6-BA 對叢生芽增殖的影響。
1.2.4 生根與壯苗培養(yǎng)
以大量元素減半的1/2MS 為基本培養(yǎng)基，設(shè)置NAA、香蕉泥和AC3 因素和3 水平，NAA水平1、2、3 分別為0.5、1.0、2.0 mg · L-1，香蕉泥水平1、2、3 分別為0、30、50 g · L-1，AC 水平1、2、3 分別為0.5、1.0、2.0 g· L-1，每處理接種2 瓶，每瓶10 株無根苗，重復(fù)3 次。
1.2.5 煉苗移栽
將生根好的試管苗放在溫室大棚煉苗4天，揭開瓶蓋繼續(xù)煉苗3天后用鑷子小心取出試管苗洗去根部的培養(yǎng)基，把苗全部浸入800 倍的甲基硫菌靈藥液10分鐘后，撈起自然晾干后，移栽到苔蘚、細(xì)小輕木顆粒、泥炭土、菜園土和泥炭：菜園土=1:1 基質(zhì)中，放置在溫室大棚中養(yǎng)護(hù)，保持濕度80%左右，溫度16-28℃，同時定期噴曬100倍的MS培養(yǎng)基大量元素和800 倍70%甲基托布津藥液，大約60天后統(tǒng)計苗的成活率。
1.2.6 培養(yǎng)條件
培養(yǎng)溫度25±1℃,每天光照12h,光照強(qiáng)度2000lx,培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g · L-1，pH5.6。
1.2.7 統(tǒng)計分析方法
污染率=(污染的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；褐化率=(褐化的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；死亡率=(死亡外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；成活率=(未褐化成活的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；啟動率=(啟動外植體數(shù)/存活外植體數(shù))×100%；生根率=(生根的苗數(shù)/接種的苗數(shù))×100%；芽增殖系數(shù)=統(tǒng)計時芽數(shù)/接種時芽數(shù)；平均根數(shù)=生根總數(shù)/接種苗數(shù)；移栽成活率=(成活苗數(shù)/移栽苗數(shù))×100%。用DPS 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，EXCEL 軟件進(jìn)行制表和繪圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 無菌材料獲得
2.1.1 消毒方法對側(cè)芽成活率的影響
由圖1 可以看出，四種不同消毒方法中，D方法側(cè)芽污染率最高，為69%，其次為A 方法和B方法,C方法污染率最低；而對于死亡率，D方法死亡率最低，僅為12%，其次是A 方法和C 方法,而B 方法側(cè)芽死亡率最高；從成活率來看，C方法側(cè)芽存活率最高56%，其次是A方法和B 方法,D 方法存活率最低，通過這些數(shù)據(jù)可知，升汞消毒效果比次氯酸鈉好，三次消毒比一次、二次消毒效果好。
2.1.2 不同取材季節(jié)對側(cè)芽消毒的影響
由表1 可知，三個不同取材季節(jié)中，夏季取材側(cè)芽污染率最高為32%，其次是秋季為30%，春季側(cè)芽污染率最低為22%；而對于褐化和死亡情況，秋季最高，其次是夏季，春季最低；從成活率來看，春季取材側(cè)芽成活率最高達(dá)54%,其次是夏季，為38%，最低的是秋季，僅為36%。試驗還發(fā)現(xiàn)，春季和夏季取材，側(cè)芽啟動時間短，生長速度快；而秋季取材，側(cè)芽啟動時間長，生長緩慢。因此，垂花蕙蘭側(cè)芽最佳取材季節(jié)是春季。
圖1 四種消毒方法對側(cè)芽成活率的影響

2.2 叢生芽的誘導(dǎo)
由表2 可見，當(dāng)6-BA 濃度為0.5 mg · L-1 時，叢生芽誘導(dǎo)啟動率最低，僅為47.1%。當(dāng)6-BA濃度為4.0mg·L-1 時，叢生芽誘導(dǎo)啟動率最高達(dá)100%。6-BA 濃度在0. 5-4.0 mg · L-1 范圍之間，垂花蕙蘭叢生芽啟動率隨6-BA 濃度增加而提高。6-BA 濃度在0. 5-2.0 mg · L-1 之間，芽分化較少。6-BA 濃度為4.0mg · L-1 時，芽分化較多。因此，4.0 mg · L-16-BA 適合叢生芽誘導(dǎo)。

2.3 叢芽的增殖培養(yǎng)
由表3 可看出，當(dāng)6-BA 為6.0mg · L-1 時，叢生芽增殖倍數(shù)最大，為4.1。當(dāng)6-BA 濃度為在2.0-6.0mg · L-1之間，叢生芽數(shù)隨其濃度增大而提高。但當(dāng)6-BA 為8.0 mg · L-1 時，叢生芽增殖系數(shù)降至3.2。叢生芽質(zhì)量隨著6-BA 濃度增大逐漸由健壯變?yōu)槔w弱。適當(dāng)提高6-BA 濃度有利于叢生芽的增殖，濃度過高，則抑制叢生芽的增殖。綜合考慮，本試驗6-BA濃度4.0mg·L-1 適合叢生芽增殖。

2.4 生根與壯苗培養(yǎng)
由生根率方差分析(表5)可知，NAA 對叢芽增殖苗生根率影響極顯著，香蕉泥對生根率影響顯著，而活性碳對生根率影響不顯著。說明NAA 是影響生根率最主要因素。香蕉泥對試管的生根率也有促進(jìn)作用。由生根數(shù)方差分析(表5)可知，NAA 和香蕉泥對叢生芽增殖苗生根條數(shù)有極顯著影響，活性炭顯著影響生根數(shù)。比較NAA 和香蕉泥的F 值可知，NAA 是影響叢生芽增殖苗生根的最主要因素，其次香蕉泥，再次是活性炭。對NAA、香蕉泥和活性碳各水平進(jìn)行多重比較見表6。

由表6 可知，NAA三水平間，NAA水平3（2mg·L-1）的生根率和平均根數(shù)與水平1（0.5mg · L-1）、水平2（1 mg · L-1）差異極顯著，水平2（1 mg · L-1）與水平1（0.5 mg · L-1）差異也極顯著�？梢哉f明，在0.5-
2.0mg · L-1 濃度范圍，生根率和平均根數(shù)隨NAA 濃度升高而升高。NAA 濃度為2.0mg · L-1 時，生根率最高，平均根數(shù)也最多。
由表6 可以看出，香蕉泥三水平間，水平3（50 g · L-1）生根率與水平1（0 g · L-1）差異顯著，水平3（50 g · L-1）與水平2（30 g · L-1）、水平1（0 g · L-1）與水平2（30 g · L-1）差異不顯著。三水平之間
的平均根數(shù)差異極顯著。說明，添加一定量的香蕉泥能促進(jìn)根的生長，本試驗香蕉泥濃度為50 g · L-1 時，生根效果最好。
由表6 可知，AC 三水平的生根率差異不顯著。水平2（1 g · L-1）平均根數(shù)與水平1（0.5g · L-1）、水平3（2 g · L-1）差異顯著。平均生根數(shù)隨著AC 濃度升高先升高后降低，本試驗AC 濃度為1 g · L-1 時，生根培
養(yǎng)效果最好。
綜上所述，適宜垂花蕙蘭叢生芽苗生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA2.0 mg · L-1+香蕉泥50 g · L-1+AC1 g · L-1。

2.5 煉苗和移栽
由表7 可看出，五種基質(zhì)中，以苔蘚為最好，成活率可達(dá)100%，苗生長健壯，葉片濃綠富有光澤；其次是細(xì)小輕木顆粒，成活率為86%，苗生長較好，葉片黃綠根系發(fā)達(dá)；泥炭土移栽效果一般，成活率也只有68%；移栽效果最差的基質(zhì)是菜園土，成活率為54%，苗呈萎蔫狀，不生長�？梢姡�本試驗垂花蕙蘭瓶苗移栽最佳基質(zhì)是苔蘚。

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