國(guó)蘭莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)

中國(guó)蘭新芽生長(zhǎng)期正值南方高溫高濕的多雨季節(jié)，雜菌繁衍猖獗，土壤、介質(zhì)中帶菌尤為嚴(yán)重。供接種取樣的蘭盆介質(zhì)應(yīng)盡少帶雜菌，不施有機(jī)肥，放置在透光避雨處，當(dāng)新芽初露時(shí)即讓幼芽裸器上面。取6～13cm長(zhǎng)的新芽，從植株基部切高，用刮刀除去根、贓物和外包葉2～3片，充分洗凈后將材料再切取2～3cm長(zhǎng)，在10％次氯酸的藥液中消毒10分鐘。如帶菌嚴(yán)重，應(yīng)用0．I1%升汞和飽和漂白粉上清波交叉消毒。滅菌后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，再放到滅菌濾紙上吸干水許，然后在解剖鏡下無(wú)菌操作利取莖尖和腋芽。如果以去病毒為目的，所剝?nèi)〉那o尖應(yīng)在O．2mm以下，否則可剝?nèi)?mm以上莖類，帶2個(gè)葉原基，有利于成活。（一）、原球莖的誘導(dǎo) 蘭花各個(gè)部分的離體組織部能誘導(dǎo)形成原球莖，再經(jīng)分化培養(yǎng)形成植株。一旦形成原球莖后，就能不斷分割繼隊(duì)培養(yǎng)增殖起來(lái)，也就是建立了無(wú)性繁殖系。蘭花的原球莖生命力強(qiáng)，遺傳性狀穩(wěn)定，對(duì)快速繁殖及種質(zhì)資源保存極為有利。外植體接種后放置在23一25度的黑暗條件下培養(yǎng)，1～2十月后可分比出1至數(shù)個(gè)乳白色的原球莖，在解剖鏡下觀察類似桑果形狀的園球突起，以后轉(zhuǎn)綠，再經(jīng)培養(yǎng)易呈根狀莖（或呈樹(shù)枝狀的叢生形），。影響蘭花原球莖誘導(dǎo)成功的因素有： 1、品種的影響：不同品種由于遺傳類型、內(nèi)源激素和多酚類物質(zhì)含量等囚素的差異，誘導(dǎo)啟動(dòng)的難度也不盡相同。 2、培養(yǎng)基的影響：各品種對(duì)不同培養(yǎng)基的適應(yīng)程度不一樣。春蘭類品種以White＋BA；＋NAA5＋CM8．5％和B11+BA＋NAA2為好。“夏蕙”、“秋素”等則以MS＋BA0.5＋NAA1十活性炭0.5％的培養(yǎng)基為好。初步觀察，春蘭品種適應(yīng)以無(wú)機(jī)鹽濃度和氨態(tài)氮含量低，而生長(zhǎng)素含量高的培養(yǎng)基。“夏蕙”、“秋素”等品種則適應(yīng)無(wú)機(jī)鹽濃度較高、生長(zhǎng)素含量較低的培養(yǎng)基。 3、新芽氏度及材料類別的影響：莖尖無(wú)論啟動(dòng)率和成功率均高于測(cè)芽以9～13公分的新芽誘導(dǎo)，成功率最高。 4、誘導(dǎo)啟動(dòng)后褐變死亡的影響：國(guó)蘭品種的莖頂接種后成活并膨大呈桑果狀原球莖因?yàn)閱?dòng)，成功率尚好，但啟動(dòng)后容易褐變死亡，是國(guó)蘭組培失敗的原因之一。據(jù)四川農(nóng)科院生物技術(shù)研究所的資料，褐變死亡數(shù)幾乎占3／4。由于國(guó)蘭芽端具有較多的多酚氧化酶，經(jīng)莖項(xiàng)培養(yǎng)易褐化而死亡，如采用較大的外植體接種，降低培養(yǎng)溫度、暗培養(yǎng)、盡量減少傷口面以及在培養(yǎng)基中附加褐變抑制劑（常用抗氧化劑，如蕓香苷，檸檬酸等），或配合應(yīng)用活性炭等，有減輕褐變死亡的效果。（二）、蘭科植物多通過(guò)原球莖途徑分化形成植株。熱帶蘭原球莖多呈園球狀，國(guó)蘭的原球莖則呈叢生狀（根狀莖）。原球莖形成階段是蘭花大量繁殖的有利階段，是快速繁殖，提高增殖率的重要環(huán)節(jié)。莖尖，側(cè)芽接種3～6個(gè)月后，根狀莖形成時(shí)即可分割繼代，增殖培養(yǎng)基以W和B11為基本培養(yǎng)基，附加NAA1～2的液體培養(yǎng)基為宜。放置在漫轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)床上加光培養(yǎng)（1～2轉(zhuǎn)／分），每隔15天更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)繼代3～4次后，又轉(zhuǎn)入相同成分，附加有活性炭（0．3％）和檸檬酸（500mg/1）的固體培養(yǎng)基，每月繼代一次。液培、固培交替進(jìn)行。增殖培養(yǎng)中，原球莖的分割不可太�。慌囵B(yǎng)群體不宜太少；培養(yǎng)液則不可過(guò)多；繼代培養(yǎng)時(shí)間不可太長(zhǎng)，否則原球莖生長(zhǎng)不良，甚至死亡。原球莖可以不斷地再分割、增殖，這樣就建立了無(wú)性系。國(guó)蘭原球莖的繼件次數(shù)和時(shí)間還有待探索，但從已繼代3～5年的原球莖來(lái)看，仍保持正常的增殖和分比能力。

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