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銀杏樹愈傷組織培養(yǎng)概述
銀杏是目前地球上最原始的裸子植物之一，是新生代第四紀冰川期的孑遺植物，素有“活化石”之稱的銀杏現(xiàn)僅存一科一屬一種，它原產(chǎn)于我國，具有及其重要的科學研究意義和藥用開發(fā)價值。銀杏細胞中含有黃酮類和內(nèi)酯類物質(zhì)，對心腦血管疾病療效顯著。利用銀杏組織培養(yǎng)技術(shù)可以生產(chǎn)這些物質(zhì)起治療和預防的作用。自20世紀90年代以來，一些學者開始對銀杏的胚、莖端和配子體等組織培養(yǎng)。近年來，細胞懸浮培養(yǎng)得到了廣泛的研究，本文章綜述了國內(nèi)外銀杏組織培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀并對其工業(yè)應(yīng)用前景進行了顧。
一、 銀杏愈傷組織培養(yǎng)
(一胚培養(yǎng)
夕卜植體的來源及其發(fā)育階段對胚發(fā)生意義重大。一般對于胚來說，子葉、胚珠、胚等，都是較理想的外植體。選取實驗材料時不宜選取新生的種子，這樣的種子胚過嫩過小，不宜剝離，應(yīng)采用顆粒飽滿、未發(fā)生霉變且誘導率高的成熟種子。胚的消毒常常采用70%的酒精消毒2～3分鐘，再放人0.1%升汞溶液中減壓滅囷20分鐘左右，再用無囷水漂洗3～5次，然后用刀片挑出胚，將胚整體或切成兩段后用滅菌濾紙吸干水分，即可用來接種。對于胚的離體培養(yǎng)，常常采用MS和N6培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基。若用于誘導胚芽生長，貝何向培養(yǎng)基中添加一定濃度的NAA或BA；若用于誘導生根，則常向培養(yǎng)基中添加適量得2，4-D。此外，少量的還原氮如0.1mmol/LNH4CD即可明顯的促進胚狀體的生成。
(二莖培養(yǎng)
剪除銀杏枝條的葉片和葉柄，用漂白粉和升汞溶液進行滅菌，經(jīng)無菌水漂洗后，從芽上切取長約0.5cm的莖尖，進行接種。接種的培養(yǎng)基采用改良的White培養(yǎng)基：White+BA0.5—1.0mg/L+NAA0.5mg/L+NH4Cl5.34mg/L+白糖4%。光照對于愈傷組織的形成有抑制作用，可以對材料進行一周的暗處理，在轉(zhuǎn)移至自然光下促進莖的分化。銀杏莖段的組織培養(yǎng)取得一些突破，有人通過銀杏莖段的離體組織培養(yǎng)已得到了叢生芽，但數(shù)量極較少。另外，活性炭、改良MS培養(yǎng)基和多效唑等都可以促進腋芽萌動和分化。
三配子體培養(yǎng)
也有不少人嘗試用銀杏花粉作為材料進行離體培養(yǎng)。銀杏花粉細胞具有銀杏的全套遺傳物質(zhì)，腿迄今為止尚無成功利用銀杏花粉誘導出完整銀杏幼苗的報道。Laumh等和陳學森等做了銀杏花粉和雌配子體原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)實驗，該實驗雖未獲得完整再生植株，但是Lauras等在進行對銀杏花粉原生質(zhì)體培養(yǎng)的過程中，首次誘導出處于不同時期的胚狀體，是銀杏配子體培養(yǎng)的一個重大突破。原生質(zhì)體培養(yǎng)仍是大部分+對木再生植株的難題，花粉的發(fā)育受不同因素影響，由配子得到完整銀杏植株目前只存在理論的可能性，所以銀杏配子體得培養(yǎng)仍是一個未攻克的雜。
二、銀杏愈傷組織的誘導
不同銀杏外組織的誘導能力有區(qū)別，其誘導率由高到低是子葉、葉片、莖段。銀杏愈傷組織誘導及生長狀況也與培養(yǎng)基、激素以及無機鹽含量有關(guān)。例如：莖的最適培養(yǎng)基為N6培養(yǎng)基；葉及葉柄最適培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基;改良的MS培養(yǎng)基對葉、胚、葉柄和莖愈傷組織的誘導具有顯著效果，而根在各種培養(yǎng)基上的誘導效果都不理想。此外，激素對于愈傷組織的誘導也有重要影響：2，4-D誘導能力強，細胞老化速度快；激素NAA活性不高，誘導力弱；NAA與6-BA按一定濃度配合使用，最適合于誘導幼葉分化出愈傷組織，而2，4-D、KT和KT與6-BA組合，不能使銀杏幼葉產(chǎn)生愈傷組織或者誘導率很低。另外，高壓靜電處理和添加椰汁或瓊月脂糖等也被證明有利用愈傷組織的誘導。
三、銀杏愈傷組織培養(yǎng)的利用
㈠銀杏組織培養(yǎng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法生產(chǎn)銀杏黃酮和內(nèi)酯
銀杏細胞含有黃酮和內(nèi)酯物質(zhì)，具有潛在的藥用價值。試驗證明，銀杏葉提取物對血管擴張，加速血液循環(huán)，降低血壓效果顯著。目前市場上的黃酮化合物多是從銀杏葉片中提取，易受到地理、氣候等因素的限制。此外，而內(nèi)酯和黃酮化合物在銀杏細胞中含量較低，加上銀杏栽培占用大量耕^地，種種因素導致黃酮的產(chǎn)量供不應(yīng)求，價格居高不下。所以通過銀杏愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)內(nèi)酯及黃酮化合物具有廣闊的前景，其優(yōu)勢在于不受季節(jié)和地域影響、產(chǎn)量高、成本低、周期短，并且能多進行自動化控制。
二利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化生產(chǎn)銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯
雖然銀杏愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)趨近成熟，但離體分化過程難以控制，至今尚未有建立起完善的再生培養(yǎng)體系，所以針對銀杏遺傳轉(zhuǎn)化研究課題較為單一，難度也較大。目前對銀杏遺傳轉(zhuǎn)化的報道都是利用一些菌株，如發(fā)根農(nóng)桿菌通過遺傳轉(zhuǎn)化生產(chǎn)銀杏黃酮化合物和內(nèi)酯，此方'法現(xiàn)已發(fā)展成為繼細胞培養(yǎng)技術(shù)之后的又一新的培養(yǎng)技術(shù)。Laurain等首次利艦侵染胚實驗，成功進行了發(fā)根培養(yǎng)，證明了銀杏組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生銀杏內(nèi)酯。隨后，張倫等利用不同的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株：R15834，R1000和A4，對銀杏幼葉、芽和莖端進行轉(zhuǎn)化，除A4外，均能誘導獲得了毛狀根，并檢測到農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的部分遺傳物質(zhì)已整合到銀杏細胞的基因組中。實驗證明通過發(fā)根農(nóng)桿菌進行基因轉(zhuǎn)化是可能的，但毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)的建立至今尚未成功。
四、 銀杏愈傷組織培養(yǎng)的發(fā)展前景
銀杏植株物種價值高，用途廣泛。如今心腦血管疾病成為人類健康的一大隱患，而利用銀杏組織生產(chǎn)促進血液循環(huán)的銀杏黃酮類化合物、銀杏內(nèi)酯等次生物質(zhì)的生產(chǎn)上也就越細受到重視。此外，銀杏繁殖能力差，如何利用體外離體組織培養(yǎng)對銀杏這一古老的裸子植物就行快速的繁殖也是一個研究課題。當然銀杏細胞培養(yǎng)也存在一系列問題，如細胞褐化現(xiàn)象，未建立完整的再生體系以及遺傳轉(zhuǎn)化困難等�？偟恼f來，銀杏細胞培養(yǎng)為內(nèi)酯和黃酮化合物的生產(chǎn)以及銀杏這一古老植物的傲戶提供了一種經(jīng)濟而有效的途徑。
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