青天葵組培物超低溫保存研究

2011/8/10 9:04:10

【摘要】目的用超低溫方法保存青天葵組培物。方法采用單因子比較法、均勻設(shè)計法考察生長周齡、冷凍保護(hù)劑、預(yù)培養(yǎng)時間、降溫方式、化凍方式等因素對青天葵組培物超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響。結(jié)果青天葵組培物較佳的超低溫保存程序為：５周齡的組培物，在４℃進(jìn)行低溫鍛煉１２ｄ，以１２．５％ＤＭＳＯ＋０．２５％ＬＨ為冷凍保護(hù)劑，在４℃靜置處理３０ｍｉｎ，然后在－１８℃，停留１ｈ后投入液氮中保存，材料取出后，在２０℃化凍，無菌洗滌后，再接種，組培物能夠存活并繼續(xù)生長。結(jié)論超低溫保存方式可以成功保存青天葵組培物種質(zhì)資源。

青天葵別名獨葉蓮、青蓮、天葵、芋蘭等，來源于蘭科多年生宿根草本植物毛唇芋蘭Nerviliafordii（Ｈａｎｃｅ）Ｓｃｈｌｔｒ．，以葉或帶塊莖的葉入藥［１］，有清肺止咳、健脾消積、鎮(zhèn)靜止痛、清熱解毒、散結(jié)消疬之功效，主治肺癆、咳嗽咳血、瘰疬、腫毒、跌打損傷、小兒疳積、精神病、口腔炎、急性咽喉炎等，對小兒肺炎有特效。

由于青天葵種子無胚乳，僅靠無性繁殖，自然繁殖數(shù)量少，繁殖系數(shù)極低，資源分布極其有限。多年來，因亂采亂挖，多是連葉帶塊莖采挖加工，導(dǎo)致野生青天葵資源日益枯竭。

我們已經(jīng)開展青天葵組織培養(yǎng)及植株再生的研究工作［２］，本研究青天葵組培物超低溫保存的影響因素，為青天葵資源再生和種質(zhì)保存提供技術(shù)資料和理論依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料本實驗所用青天葵組培物是由青天葵球莖誘導(dǎo)產(chǎn)生的根狀莖。在含有６－ＢＡ２ｍｇ•Ｌ－１的ＭＳ培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度（２５±２）℃，每天光照１２ｈ，光照強度１２００Ｌｘ。經(jīng)不同周齡對比試驗后，采用５周齡的組培物作為超低溫保存的試驗材料。

１．２方法

１．２．１冷凍保護(hù)劑考察ＤＭＳＯ，Ｇｌｙ（甘油），ＰＥＧ（聚乙二醇），Ｓｕｃ（蔗糖），Ｇｌｕ（葡萄糖），ＬＨ（水解酪蛋白）６種冷凍保護(hù)劑及其不同濃度配比的冷凍保護(hù)效果。

１．２．２預(yù)培養(yǎng)將組培物轉(zhuǎn)至含５％ＤＭＳＯ（二甲基亞砜）的ＭＳ培養(yǎng)基上，置于４℃進(jìn)行零上低溫鍛煉�？疾煸诖藯l件下預(yù)培養(yǎng)時間對超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響。

１．２．３冷凍程序?qū)⒔M培物放入５ｍｌ聚乙烯塑料冷凍管中，加入０℃預(yù)冷的保護(hù)劑，使之淹沒組培物，旋緊管塞，在４℃靜置處理３０ｍｉｎ。然后將冷凍管放入－１８℃，停留一定時間后投入液氮中保存�？疾煸冢�１８℃溫度下停留不同時間（０．５，１，２，３，４，５，６，７，８ｈ），對超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響。

１．２．４化凍與洗滌材料從液氮中取出化凍�？疾觳煌�的化凍方式：４℃零上低溫，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０℃的化凍效果。

待冷凍管中的冰融化后，立即加入ＭＳ培養(yǎng)液（大量元素＋３％蔗糖），輕輕振搖，停留１０ｍｉｎ，傾出溶液，如此反復(fù)洗滌３～５次。

１．２．５細(xì)胞生活力的檢測按簡令成［３］報道的方法：稱取洗滌后的組培物２００ｍｇ，加入５ｍｌ氯化三苯四氮唑（ＴＴＣ）液，在黑暗條件下靜置染色２０ｈ。吸去ＴＴＣ液，用蒸餾水洗滌３次。加入丙醇研磨提�。裕裕帽幻摎涿高�原后生成的紅色甲。用７５５型分光光度計，在４９０ｎｍ處測試丙醇提取液的吸收值。用這個吸收值（ＴＴＣ）值表示各處理的愈傷組織經(jīng)超低溫保存后的細(xì)胞生活力。

２結(jié)果分析

２．１組培物生長周齡對超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響細(xì)胞抗凍能力的提高與其分裂和生長活動等生理狀態(tài)密切相關(guān)。取轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上的組培物，考察不同的生長周齡（１，２，３，４，５，６，７周）對組培物經(jīng)超低溫保存后的細(xì)胞生活力。

由圖１知，將組培物轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基上，開始１周，冷凍后細(xì)胞的ＴＴＣ值較低，說明細(xì)胞的抗凍能力弱，培養(yǎng)至第２周時，ＴＴＣ值迅速升高，細(xì)胞抗凍能力顯著增強，第５周的ＴＴＣ值最高，此時細(xì)胞的抗凍能力最強，此后，隨著培養(yǎng)周齡的增加，ＴＴＣ值呈下降趨勢，細(xì)胞抗凍能力逐漸減弱。因此選擇５周齡的組培物作為超低溫保存的材料是適宜的。

２．２冷凍保護(hù)劑對超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響結(jié)果見表１～２。

表1U12（12）12均勻設(shè)計因子水平（略）

按表１均勻設(shè)計搭配，組合成１２種方案進(jìn)行試驗，結(jié)果見表２。

表2U12（12）12均勻設(shè)計實驗安排及結(jié)果（略）

數(shù)據(jù)經(jīng)逐步回歸處理，得到方程Y＝０．３６９＋０．００４X１２＋４．４９５X６２，R＝０．９０７＞０．９，F(xiàn)＝２０．９２５＞F（７，４）＝１４．６８，方程有顯著性意義。由方程知，Ｘ１２和Ｘ２２對Ｙ值有顯著影響，均與Ｙ值呈正相關(guān)。對方程優(yōu)化得X１＝１２．５，X６＝０．２５，將其代入方程，得到優(yōu)化值１．２７５，按公式計算。當(dāng)α＝０．１０，Uα＝１．６４４８，計算優(yōu)化值區(qū)間估計為Y＝１．２７５±１．６４４８×０．１２，即１．０７８～１．４７２。按照優(yōu)化條件進(jìn)行試驗，得到TTC值為１．２８１，在Y值區(qū)域內(nèi)，且比１２次均勻試驗Y值都高，說明所得結(jié)果是正確的，因此認(rèn)為１２．５％ＤＭＳＯ＋０．２５％ＬＨ是青天葵組織培養(yǎng)物較佳的冷凍保護(hù)劑。

２．３組培物預(yù)培養(yǎng)時間對超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響結(jié)果見圖２。圖２表明，未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的組培物，細(xì)胞TTC值最低，抗凍能力較弱，預(yù)培養(yǎng)３ｄ后，TTC值開始上升，細(xì)胞抗凍能力逐漸增強，到１２ｄ時TTC值達(dá)最大，此時細(xì)胞抗凍能力最強，此后延長預(yù)培養(yǎng)時間，TTC值呈下降趨勢，因此試驗材料應(yīng)在４℃預(yù)培養(yǎng)１２ｄ后再進(jìn)行超低溫保存。

２．４降溫方式對超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響實驗比較快凍法（從０℃直接投入液氮中保存）和兩步冷凍法的冷凍效果，著重考察兩步法中在－１８℃停留不同時間（０．５，１，２，３，４，５，６，７，８ｈ）對冷凍保存后細(xì)胞生活力的影響。結(jié)果見圖３。

圖3降溫方式對冷凍后細(xì)胞生活力的影響（略）

圖３表明，兩步冷凍法的效果優(yōu)于快速冷凍法，采用兩步冷凍法從０℃緩慢降溫至－１８℃時，不立即投入液氮中而在此溫度下停留１ｈ，冷凍后細(xì)胞生活力明顯提高，因此降溫方式以從０℃降溫至－１８℃，停留１ｈ，然后投入液氮保存。

２．５化霜凍方式對超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響結(jié)果見圖４。圖４表明，冰箱內(nèi)４℃化凍和４０℃以上高溫化凍的TTC值較低，細(xì)胞生活力較弱，１０℃和３０℃化凍效果接近，２０℃化凍TTC值最高，說明化凍后細(xì)胞保持了較高的生活力，因此２０℃化凍是較好的化凍方式。

圖4化凍方式對冷凍后細(xì)胞生活力的影響（略）

２．６超低溫保存后組培物的再生長將化凍后的組培物，用無菌的ＭＳ液沖洗后，轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基上，先黑暗培養(yǎng)２周，后進(jìn)行光照培養(yǎng)，組培物能夠存活，統(tǒng)計存活率為６６．７％，將其轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基上根狀莖可以繼續(xù)生長并有新的根狀莖從節(jié)的部位生出。

【參考文獻(xiàn)】

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院．中藥大辭典，上冊［Ｍ］．上海：上海科技出版社，１９９３：１２３１．

［2］杜勤，陳文利，王振華，等．青天葵組織培養(yǎng)和植株再生研究［Ｊ］．中國中藥雜志，２００５，３（１）：８１２．

［3］簡令成，孫德蘭，孫龍華．甘蔗愈傷組織超低溫保存中一些因素的研究［Ｊ］．植物學(xué)報，１９８７，２９（２）：１２３．

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