植物愈傷組織培養(yǎng)

2011/6/13 8:41:47

一、原理
植物組織培養(yǎng)是指在無菌條件下，對離體植物組織（器官或細(xì)胞）分離并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其能夠繼續(xù)生長，甚至分化發(fā)育成一完整的植株的一門實(shí)驗(yàn)技術(shù)。組織培養(yǎng)的理論依據(jù)是植物細(xì)胞的全能性，即植物體的每個細(xì)胞攜帶著一套完整的基因組，因此具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。植物組織當(dāng)中原本已經(jīng)分化的細(xì)胞，一旦脫離原有的機(jī)體環(huán)境，成為離體狀態(tài)，在適宜的營養(yǎng)和外界條件下，就會表現(xiàn)出全能性，從已經(jīng)分化定型的細(xì)胞，脫分化，成為恢復(fù)分裂能力的細(xì)胞，并能重新生長發(fā)育成完整的植株。
愈傷組織是指一個離體的細(xì)胞、一塊組織或一個器官的細(xì)胞，通過脫分化不斷分裂、增生子細(xì)胞，這些細(xì)胞胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明，逐漸形成了無序結(jié)構(gòu)的一團(tuán)細(xì)胞。
二、試劑及儀器
（一）儀器設(shè)備
超凈工作臺、高壓滅菌鍋、微波爐、人工氣候箱、電子天平、移液器（1-5ml）、恒溫磁力攪拌器、酸度計(jì)、手術(shù)刀、手術(shù)剪、稱量紙、皮筋、封口膜、三角燒瓶（500ml、100ml）、量筒、燒杯（1000ml）、試劑瓶（1000ml、100ml）、長鑷子、記號筆（或標(biāo)簽紙）、培養(yǎng)皿、酒精燈、打孔器
（二）試劑
75% 酒精、次氯酸鈉（或H2O2）、植物生長激素、蔗糖、脂粉、HCl、NaOH、KH2PO4、CoCl2?6H2O、煙酸、鹽酸-硫胺素（VB1）、鹽酸-吡哆醇（VB6）、肌醇、甘氨酸
三、實(shí)驗(yàn)步驟
（一） 培養(yǎng)基配制
1. 培養(yǎng)基的選擇
植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用的培養(yǎng)基，一般由無機(jī)營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)劑和有機(jī)附加物等五類物質(zhì)組成。
無機(jī)營養(yǎng)物包括大量元素和微量元素。大量元素：C、H、O、N、P、S、K、Ca、Na、Mg等，微量元素：Mn、Zn、Cu、B、Mo、Fe等。碳源一般為蔗糖。 維生素中只有硫胺素是必需的，而煙酸、維生素B6和肌醇對生長之起促進(jìn)作用。常用的生長調(diào)節(jié)劑有IAA （吲哚乙酸）、IBA（吲哚-3-丁酸）、 NAA（萘乙酸）、NOA（萘氧乙酸）、 P-CPA（對氯苯氧乙酸）、2，4-D（二氯苯氧乙酸）、2，4，5-T（三氯苯氧乙酸）；BA P（芐氨基嘌呤）、6-BA（芐基腺嘌呤）、2-Zi（異戊烯氨基嘌呤）、 KT（激動素)等。有機(jī)附加物是指甘氨酸、水解酪蛋白、椰子乳等，可促進(jìn)分化，但如培養(yǎng)基配方適當(dāng)，則大多數(shù)組織是不需要的。
培養(yǎng)基的種類、成份直接影響到培養(yǎng)材料的生長發(fā)育，故應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)植物的種類和部位，選擇適宜的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基種類繁多，最基本、最常用的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基（見表1）。
2. 培養(yǎng)基的配制
① 先按表1配制MS培養(yǎng)基貯液，②再將貯液與其他成分按比例混合。③ 此外還需加入適量的蔗糖作為碳源，起支持作用的瓊脂粉，適量的生長調(diào)節(jié)劑等。④ 將上述培養(yǎng)基加熱溶解后，加蒸餾水使培養(yǎng)基達(dá)到終體積。⑤ 再用0.1mol/L NaOH 或0.1mol/L HCl 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值至最適。⑥ 分裝至三角燒瓶，封口膜封口，等待滅菌后使用。
3. 幾種誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基
胡蘿卜MS+0.5mg/L 6BA + 0.5mg/L NAA
玫瑰葉盤，芽 MS+0.5mg/L 6BA + 0.5mg/L NAA
煙草葉盤、葉柄 MS+0.1mg/L 6BA + 0.5mg/L NAA
pH 5.8，蔗糖30%，瓊脂粉6.5g/L。
（二）滅菌
1．培養(yǎng)基及器具滅菌培養(yǎng)基、無菌水需要在高壓滅菌鍋中滅菌。滅菌作用取決于溫度，常用的滅菌溫度為121℃，所需時間應(yīng)隨要滅菌的液體的容積變化而變化（見表2）滅菌結(jié)束后待溫度下降到50℃以下，才能取出已滅菌的培養(yǎng)基。
可用同樣方法對器具同時進(jìn)行滅菌，包括：培養(yǎng)皿、解剖刀、剪子、濾紙、鑷子、打孔器等。
2．工作環(huán)境滅菌
接種前1ｈ打開超凈工作臺和棚面的紫外燈照射40min。殺菌結(jié)束后，先關(guān)掉棚面的紫外燈，再打開風(fēng)機(jī)，最后關(guān)掉超凈工作臺上的紫外燈。在接種后休息時，要先打開臺面的紫外燈，再關(guān)風(fēng)機(jī)，最后打開棚面紫外燈。不能將風(fēng)機(jī)與臺面上的紫外燈同時關(guān)閉或先關(guān)閉風(fēng)機(jī)再開紫外燈。
3 . 植物材料的滅菌
植株各部分的表面攜帶著各種微生物，他們是植物組培的污染源，所以在接種培養(yǎng)前必須進(jìn)行徹底的表面消毒；組織內(nèi)部侵染的真菌或細(xì)菌很難消除，這些組織一般淘汰不用。消毒前需用流水清洗植物材料表面污垢，再用無菌潔凈濾紙吸干水分。
植物材料的滅菌需在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，可選擇不同的滅菌劑進(jìn)行植物組織表面消毒（見表3）。同時注意，表面消毒劑對植物組織也是有毒的。因此，應(yīng)當(dāng)選擇消毒劑的濃度和時間，盡量減少組織的死亡。滅菌后，需用無菌水反復(fù)沖洗，徹底洗去表面消毒劑。
如：胡蘿卜儲藏根消毒：將胡蘿卜用洗滌靈清洗，擦干，切段。進(jìn)超凈工作臺后，先用75%酒精擦洗切段，擦干后，在2%次氯酸鈉中浸泡5秒鐘，用無菌水沖洗10 次，無菌濾紙吸干，用滅過菌的打孔器取材。準(zhǔn)備工作就緒后，可以進(jìn)行接種。
（三）接種
1. 進(jìn)臺
工作人員進(jìn)入接種室前，需要洗凈手和手腕。進(jìn)入超凈工作臺內(nèi)需用75%酒精紗布擦拭手、手腕，再擦培養(yǎng)基瓶和超凈工作臺。
2. 接種
(1) 剪、鑷消毒：接種前剪、鑷應(yīng)插入75%酒精瓶中，取出后置于酒精燈外焰上徹底灼燒，灼燒時應(yīng)將剪口、鑷口張開，燒至剪、鑷上火焰熄滅為止，冷卻后方可進(jìn)行接種。接種后仍需灼燒并插回75%酒精的磨口瓶待用。注意每次取出時剪口并攏，不可接觸磨口瓶和其它器皿，并保持尖端向下。
(2) 插植外植體：左手拿三角瓶，解開封口膜，將三角瓶幾乎水平拿著，靠近酒精燈焰，將瓶口外部在酒精燈火焰上燎數(shù)秒鐘，使瓶口的水氣散發(fā)掉。用右手拇指、食指、中指拿消毒過的鑷子夾一塊外植體送入瓶內(nèi)輕輕的插入培養(yǎng)基上，鑷子灼燒后放回磨口瓶，再把封口膜在酒精燈火焰上燎數(shù)秒，灼燎時應(yīng)旋轉(zhuǎn)，避免燒壞，蓋好封口膜，扎緊皮筋，便完成了第一瓶的操作，接著再做第二瓶，如此直到外植體全部接完。
3 注意事項(xiàng)
(1) 操作人員的頭、胳膊等不得進(jìn)入臺內(nèi)；
(2) 操作人員不得隨意談話、說笑，以免造成污染；
(3) 用酒精對雙手消毒時，務(wù)必待酒精徹底揮發(fā)后再靠近酒精燈火焰，以免火焰?zhèn)�手�?br/>(4) 臺外人員走動要輕、動作要小。
（四） 培養(yǎng)
接種或繼代培養(yǎng)的植物組織置于人工氣候箱中培養(yǎng)，溫度25±2℃，適當(dāng)光照強(qiáng)度和光周期。每4-6周繼代一次。培養(yǎng)過程如果有的培養(yǎng)物被微生物污染，應(yīng)當(dāng)馬上將其清理，以免影響其它培養(yǎng)物。

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